DOSSIER

Le fonctionnement des puces à ADN est basé sur le phénomène d'hybridation, à savoir, l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences de nucléotides.

Les puces sont hybridées avec l'acide nucléique à étudier, préalablement amplifié par PCR, et marqué, en général par un fluorochrome ou un isotope, soit au cours de l'amplification, soit après l'hybridation. L'utilisation de deux fluorochromes ou deux isotopes permet de faire du comparatif. Cette hybridation forme un duplex (double brin). Le brin dont on connaît la séquence, intégrale ou partielle, constitue la sonde et celui que l'on souhaite caractériser est la cible. Après hybridation et lavage, le signal moyen de chaque spot est enregistré grâce à un scanner pour la fluorescence ou un compteur pour la radioactivité.

En fluorescence un laser excite chaque fluorochrome et une cellule photosensible (associée à un photomultiplicateur) capte la lumière émise à raison d'une mesure tous les 5µm². On obtient alors une image en niveau de gris 16 bits (environ 6500 niveaux) que l'on va analyser à l'aide d'un système informatique.

Il existe différents types de détection : ceux qui sont utilisés aujourd'hui et ceux qui sont encore à l'étude :

1a. La détection en fluorescence

C'est l'un des types de marquage les plus utilisé pour le marquage des cibles et un jeu important de fluorochromes (FITC, Cy3, Cy5, TRITC, etc..) sont disponibles.
Ce système de détection permet une lecture directe, et même des lectures en temps réel pour étudier la cinétique des réactions d'hybridation.
La lecture peut être réalisée à l'aide de différents équipements :

un scanner, relié à système comprenant un objectif de microscope, des filtres et un photomultiplicateur,
un microscope à épifluorescence couplé à une caméra CCD.

La radioactivité est la deuxième technique de détection utilisée par les scientifiques mais elle devrait à terme être remplacée par un système plus facile à utiliser en routine, moins dangereux pour le manipulateur et moins cher en évacuation des déchets.

Les deux isotopes utilisés sont le tritium (H3) et le phosphore (P32) qui peuvent être utilisés seuls ou conjointement pour des études de comparison de gènes, de tissus ou d'états physiologiques.

Pour la révélation, il faut aussi un scanner qui puisse mesurer la radioactivité, la différencier en fonction de l'isotope et un système informatique couplé qui puisse interpréter les résultats en fonction de chaque spot.

2a. La détection chronopotentiométrique (Wang).

Elle est utilisée pour les sondes fixées sur des électrodes de carbone et utilise la propriété de réduction spontanée d'une électrode métallique cationique, au contact d'un duplex d'acides nucléiques.
La mesure réalisée est une variation de la différence de potentiel sur une durée donnée et le rapport ainsi obtenu est proportionnel à la quantité d'ADN hybridé.

2b. La détection électronique.

Une molécule d'acide nucléique possède des propriétés physico-chimiques qui vont être modifiées lorsqu'elle va s'hybrider avec une autre molécule.
Lors de l'hybridation d'une sonde avec une cible 10 fois plus longue, la fréquence de relaxation de la molécule est multipliée par 100. Le retour à l'état stable de la molécule est accompagné d'un mouvement vibratoire caractérisé par sa fréquence. La fréquence de la vibration est fonction de la dispersion diélectrique de la molécule, dispersion due aux charges négatives des groupements phosphates des chaînes. Cette dispersion dépend de ce fait de la longueur de la chaîne d'ADN. La fréquence de relaxation est accessible par une mesure d'impédance qui est l'énergie maximale absorbée par les molécules.

La lecture d'une biopuce passe donc par une étape logicielle de traitement d'image pour isoler au mieux les hybridation révélées, éliminer les bruits de fond, et surtout pour mettre en correspondance automatiquement les différentes taches de couleur et les spots.